Материалы и методы

Рефераты по химии / Прочносвязанные с целлюлозой полисахариды клеточной стенки ксилемы льна / Материалы и методы
Страница 2

13) Фильтрат 1 Заливали в диалезный мешок 12 – 14 тысяч Дальтон.

14) Диалезный мешок клали в 3-х литровую банк с дисцилированной водой и ставили на магнитную мешалку, воду в банке меняли 4 раза.

15) На роторном испарителе концентрировали раствор.

16) Хроматографируем концентрированный раствор. Готовим 40 пробирок, моем их хромкой и сушим в сушильном шкафу при 1200С.

17) На хроматографе задаем программу (по каплям, 40 пробирок, в одну пробирку 40 капель ≈ 1,8 мл.)

18) В эпиндорф вливаем концентрированный раствор и центрифугируем 5 мин. при 6 000 об/мин.

19) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN3 и АсNa 10 mM pH 5,5, разделение по молекулярным массам.

20) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм. (Смотри гафик1)

21) Выпавшую целлюлозу суспензировали в 50 мл 0,01 М растворе NaAc, рН 4,5 + 0,05% NaN3, содержавший 0,1 мл раствора целлюлазы и инкубировали в течение ночи.

22) Раствор фильтровали на воронке Шота и осадок заново суспезировали в новой порции раствора фермента. Мы получили фильтрат 2.

23) Фильтрат 2 обессоливали на колонке Sephadex G-25, элюент 0,02% NaN3. 0,005 гр. Blue Dextran 2000 кД и 0,250 гр. СоCl2 растворяли в 5 мл дисцилированной воды и хроматографируем. Blue Dextran 2000 кД начало 25 мл конец 30 мл. СоCl2 начало 60 мл. конец 73 мл.

24) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN3 и АсNa 10 mM pH 5,5, разделение по молекулярным массам.

25) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм (Смотри график2).

2.4 Моносахаридный анализ

1) Фильтрат 1 и Фильтрат 2 обессоливаем на колонке Sepharose G250, элюент 10мМ пиридин и 10мМ уксусная кислота рН 4,5.

2) Высушиваем при 600С до полного отсутствия воды.

3) Добавляем 400 мл ТФУ (Трифторуксусная кислота), помещаем в сушильный шкаф на 1 час при температуре 1200С.

4) Затем опять сушим при 600С

5) Растворяем водой и определяем моносахаридный соcтав на Daionex (Данные моносахаридного состава смотри в таблице 1).

6) Мы объединили наши пробирки в следующие фракции до целлюлазной обработки: фракция 1 5–10; фракция 2 11–16; фракция 3 17–23; фракция 4 24–26; фракция 5 27–35.

Фракции после целлюлазной обработки: фракция 1 6–10; фракция 2 11–16; фракция 3 17–19; фракция 4 20–24; фракция 5 25–26; фракция 6 27–31.

Рисунок 1 – Распределение прочносвязанных полисахаридов во фракциях после растворения целлюлозы до ферментативной обработки.

Рисунок 2 – Распределение прочносвязанных полисахаридов после растворения после ферментативной обработки

Таблица 1. Моносахаридный состав во фракциях

Рамноза

Арабиноза

Галактоза

Глюкоза

Ксилоза

Галактуроновая кислота

Глюкуроновая кислота

Фракция 1, после целлюлазы

49.290

33.680

68.173

7.624

5.855

254.246

1.166

Фракция 2, после целлюлазы

61.981

43.261

99.500

6.804

13.317

311.360

3.365

Фракция 3, после целлюлазы

25.478

17.145

79.425

6.605

31.317

161.033

10.089

Фракция 4, после целлюлазы

6.349

7.295

48.161

25.828

86.452

67.533

10.577

Фракция 5, после целлюлазы

4.020

14.716

40.078

40.401

210.336

3.171

5.546

Фракция 6, после целлюлазы

1.678

4.407

13.217

28.017

136.191

6.781

1.291

Фракция 1, до целлюлазы

0

0

0

0

0.535

358.507

0

Фракция 2, до целлюлазы

0.556

0.481

2.689

5.364

1.107

0.476

0

Фракция 3, до целлюлазы

12.596

15.664

39.576

12.444

0

21.317

1.393

Фракция 4, до целлюлазы

20.762

24.131

54.572

11.218

54.753

67.032

2.955

Фракция 5, до целлюлазы

82.195

151.536

325.976

131.493

0

426.007

19.982

Страницы: 1 2 3

Информация о химии

Химический язык как средство познания в обучения химии

  Язык, по С.И. Ожегову, - исторически сложившаяся система звуковых, словарных и грамматических средств, объективирующая работу мышления и является орудием общения, обмена мыслями и взаимного понимания людей в обществе ...

Менделеев, Дмитрий Иванович

Русский химик Дмитрий Иванович Менделеев родился в Тобольске в семье директора гимназии. Во время обучения в гимназии Менделеев имел весьма посредственные оценки, особенно по латинскому языку. В 1850 г. он поступил на отделение ес ...

Клаузиус (Clausius), Рудольф Юлиус Иммануил

Немецкий физик Рудольф Юлиус Иммануил Клаузиус родился в Кёслине, Померания. Учился в Берлинском университете (с 1840). По окончании университетского курса в Берлине он был преподавателем в Артиллерийской школе. В 1850–1857 ...