Выделение белков и установление их однородности

Выделение белков из биологических тканей проводят после тщательного измельчения исследуемого материала, вплоть до разрушения клеточной структуры. Разрушают клетки механическим путем, растирая ткань с песком в ступке или в гомогенизаторе. Существуют и другие методы, например поочередное замораживание и оттаивание, обработка ультразвуком.

На всех этапах выделения и очистки белков следует учитывать их большую способность к потере природных, нативных свойств, т.е. к денатурации.

В большинстве случаев процесс разрушения клеток сопровождается выделением тепла, поэтому с целью предотвращения тепловой денатурации все операции следует проводить при пониженных температурах (около +4°С) в термостатированных холодных комнатах.

Современные методы измельчения тканей обычно сочетают с одновременной экстракцией белков из гомогенатов тканей. В качестве растворителей используют 8-10% растворы солей, различные буферные растворы, органические растворители (спирт, ацетон и т.п.), а так же неионные детергенты –вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами.

После достижения полной экстракции белков, приступают к разделению-фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют различные методы: высаливание, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез.

При выделении и очистке белков используют четыре основных вида хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматографию по сродству). В адсорбционной хроматографии разделение компонентов смеси основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, оксиды алюминия или кремния. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в колонку и равномерно утрамбовывают. Исследуемый образец в небольшом объеме растворителя вносят в колонку. Компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте. Затем приступают к десорбции компонентов из колонки, используя подходящие элюенты. Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

При распределительной хроматографии твердая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы. Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге. В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги. Образец наносят в виде капли (пятна) на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в подходящую смесь органических растворителей (например, бутанол, уксусная кислота, вода в определенных соотношениях). При движении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами.

В ионообменной хроматографии в зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую ионообменную смолу (катионит или анионит) с функциональными группами которой обмениваются и задерживаются на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются из колонки. Связанные с ионообменной смолой белки, отделяют, применяя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.